使用Geneious快速定位基因魔剪CRISPR/cas的gRNA位點與脫靶結(jié)合位點[5]
基于機器學習翻譯，僅供參考。
練習4：找到配對的CRISPR位點
一種提高CRISPR / Cas9靶向特異性的方法是使用突變體Cas9-D10A切口酶以及與靶位點的相對鏈互補的一對引導RNA。相反鏈上的兩個單獨切口模擬雙鏈斷裂，然后導致非同源末端連接。脫靶相互作用被最小化，因為任何單個脫靶切口將通過堿基切除修復途徑以更高的保真度被修復。
在本練習中，您將使用Find CRISPR Sites在LYP1 CDS上查找配對位點。選擇LYP1 CDS文檔（geneious的demo數(shù)據(jù)文件，可以下載）并轉(zhuǎn)到克隆→查找CRISPR位點。
和前面的練習保持相同的設置，除了設置速度和過濾策略上慢-評分所有的位點，因為我們想進行評分所有位點的這項工作。
要找到配對的CRISPR位點，請勾選Pair CRISPR sites旁邊的復選框。您可以指定返回位點的最大允許重疊，以及配對位點之間允許的最大空間。位點之間的最大重疊和最大空間從CRISPR位點的5'，PAM遠端測量。我們將分別使用默認選項6和16。
對話框現(xiàn)在應該如下圖所示。點擊確定運行搜索。
Geneious已經(jīng)注釋了三對CRISPR位點。
當使用Pair CRISPR位點選項時，Geneious將只注釋至少有一對位點給定位點設置之間的最大重疊和最大空間。在這些設置中沒有配對的位點沒有注釋。
每對CRISPR位點都有一個“配對的CRISPR評分”。如果您將鼠標放在其中一個CRISPR注釋上，則可以查看該位點的配對CRISPR分數(shù)。這個綜合分數(shù)是兩個CRISPR分數(shù)的平均值。具有最高綜合得分的CRISPR位點對相關聯(lián)。每個CRISPR位點都將鏈接到其得分最高的配對位點，除非該第二個位點與另一個位點的得分更高。這對位點根據(jù)他們的配對分數(shù)進行著色，而不是他們各自的CRISPR分數(shù)。
恭喜，你現(xiàn)在已經(jīng)完成了CRISPR教程。完結(jié)。