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CRISPR設(shè)計工具的用途

CRISPR設(shè)計工具是一種網(wǎng)絡(luò)工具，旨在通過以下方式簡化CRISPR指南在輸入DNA序列中的選擇過程：（i）發(fā)現(xiàn)全基因組可能的非靶標(biāo)，（ii）突出顯示具有高靶特異性的指南，以及（iii）目標(biāo)基因組中的許多或基因外源目標(biāo)。

使用CRISPR設(shè)計

要使用CRISPR設(shè)計位點工具，只需：

1. 前往crispr.mit.edu的提交頁面
2. 進(jìn)入DNA序列
3. 選擇一個目標(biāo)基因組，

將掃描序列以尋找可能的CRISPR指南（20個核苷酸，然后是PAM序列：NGG），并在整個選擇的基因組中掃描可能的目標(biāo)匹配。作業(yè)輸出將顯示在作業(yè)輸出頁面上，每個指南鏈接到一個非目標(biāo)列表，并按照從零到100％的分?jǐn)?shù)順序呈現(xiàn)，粗略地表示每個指南的忠實的目標(biāo)活動。

解釋分?jǐn)?shù)

CRISPR設(shè)計工具輸出頁面：

呈現(xiàn)查詢序列中所有可能的指南的排名列表，按照100％減去目標(biāo)基因組中的目標(biāo)活動的信仰度排序，減去目標(biāo)基因組中的目標(biāo)命中分?jǐn)?shù)的加權(quán)和。

顯示每個指南的頂級匹配的目標(biāo)命中分?jǐn)?shù)，并且通過考慮錯配總數(shù)，絕對位置不匹配來計算 - 以適應(yīng)接近PAM站點的相對較高的不匹配干擾，以及不匹配之間的平均配對距離 - 解釋中斷鄰近錯配對破壞指導(dǎo)-DNA相互作用的空間影響。

單擊的分?jǐn)?shù)

用于評分單個目標(biāo)的實際算法是：

在第一學(xué)期內(nèi)，e運(yùn)行在導(dǎo)向和非目標(biāo)之間的不匹配位置，M：

代表實驗確定的不匹配位置對靶向的影響。（Hsu等，Nature Biotechnology 2013）

而且，術(shù)語二和三分別表示錯配（d）的平均配對距離和高度不匹配目標(biāo)的阻尼懲罰的影響。

指南匯總分?jǐn)?shù)

一旦個人點擊得分，每個指南都會得到一個分?jǐn)?shù)：

并且根據(jù)指導(dǎo)質(zhì)量的廣泛分類進(jìn)行著色，考慮到高分離目標(biāo)中存在或不存在標(biāo)記基因，表明在查詢區(qū)域中使用特定指導(dǎo)用于特定目標(biāo)的相對（不）有利度。

指南選擇

聚合得分大于50％的指南是綠色的，并且如果沒有得分偏高的目標(biāo)落在標(biāo)記的基因區(qū)域中（如右表所示），則應(yīng)該被視為候選靶向序列。如果沒有合適的綠色指南清除高分，極端目標(biāo)，那么指定黃色的指南應(yīng)視為具體目標(biāo)的備份。紅色指南在目標(biāo)基因組中有很多可能的目標(biāo)相互作用，應(yīng)該避免。